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          mRNA的表达,是分子生物学研究过程中经常需要检测的。它不仅仅受到各种调控之后会发生变化,更会影响下游蛋白质的表达。我们常常采用芯片、测序或者PCR等方法来检测基因表达,但是有些实验的细节常常为大家所忽略,有一句话,叫做细节决定成败,也许你忽略的一个小操作,就影响了实验的最终结果。我们今天来说说其中的一个细节,基因组DNA(gDNA)的污染。
         目前所有RNA抽提方法制备的RNA样品都有含量不等的gDNA的污染,以下展示了一个实验案例来说明这个问题:


    方法:
    研究人员使用以下四种不同方法抽提小鼠肝细胞总RNA。
    样本
    1
    2
    3
    4
    5
    处理
    某公司kit1
    氯化铯离心
    Trizol 抽提
    某公司kit2
    H2O Control
        
    然后将样品分为两组:
    RT-PCR            以上方法抽提RNA后反转录,并进行PCR扩增
    PCR Control    以上方法抽提RNA后不经过反转录,直接进行扩增

    结果:
    如图1所示,所有PCR产物中都有目的片段大小的扩增产物。
    图1
       
    结论:
          基因组DNA(gDNA)会显著影响低丰度mRNA的基因表达检测结果。

     
            很多科研人员想问,gDNA对Realtime PCR结果的影响到底有多大呢?以下的实验案例说明了这个问题。

    方法:
    实验人员对同样的样品,设置了4组进行实验:
    Untreated:  没有去除基因组DNA污染的RNA进行直接反转录;
    Untreated/NRT: 没有去除基因组DNA污染同时也没有反转录;
    RT-PCR with gDNA Elimination Buffer:  去除基因组DNA后进行反转录;
    NRT with gDNA Elimination Buffer:  去除基因组DNA污染后没有进行反转录;

    结果:
    FOXP3基因的Ct值在gDNA去除前后分别是29.2和33.2,这4个Ct值的差值说明gDNA中该基因的拷贝数是cDNA中所含的该基因拷贝数的15倍。
    FOXP3基因在不经过反转录的样品里,没有去除gDNA的一组明显可以扩增出产物,经过gDNA去除的一组就没有扩增出产物来。
     
      图2A   图2B

    结论:
    污染的gDNA会显著影响后续Realtime PCR结果的Ct值,尤其当基因表达量低的时候。
     

    避免gDNA污染影响检测结果的方法有哪些?
     
    一:DNaseⅠ处理
         但是采用传统热失活gDNA的方法会影响到后续Realtime PCR反应。采用gDNA去除试剂盒,可以方便有效的去除污染的gDNA后,同时不影响后续的Realtime PCR。
     
    二:设计跨内含子引物和设置no-RT对照
         在设计引物时,最大限度降低gDNA污染的办法就是在可能的情况下采用至少跨一个内含子的引物对,这将导致由污染的gDNA扩增的产物大小明显大于由cDNA扩增的产物。如果可能,引物对可以设计跨足够大内含子片段从而导致污染的gDNA无法被扩增。此外,由于哺乳动物基因组的一些基因存在假基因,包括最常用的内参基因(?-actin, GAPDH,cyclophilin)。已加工的假基因由于不含有内含子,它的PCR扩增产物大小和cDNA扩增产物大小相同而不能区分。研究人员设置了如图3所示的“no-RT”对照,来自于RNA的目的扩增产物大小是361bp,“no-RT”对照产生了两条产物,一条是大小和目的产物相同的来自于假基因的扩增产物,一条来自于gDNA的扩增产物。如果需要完全避免假基因的干扰,可以对假基因的扩增产物进行测序,然后引物设计在假基因和基因组序列不一样的区域,引物3’端的一个或两个碱基的差异即可完全抑制假基因的扩增。
     
    图3
     
    如何知道样品中是否混有gDNA,如何检测gDNA是否已经去除干净呢?。
     


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