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  • 适用于RNA水平检测的样品准备


    适用于PCR芯片、表达谱基因芯片、Real Time PCR RNA水平检测的样品准备
     
    1.         Total RNA
    1.1.        质量和数量要求
    (1)质量要求:甲醛变性胶电泳,泳条带清晰,28S 不 18S rRNA 条带的比值等于或大于 1:1;紫外分光检测 OD 260/280 通常在 1.7-2.2 之间。
    (2)数量要求:total RNA最好达到3µg以上。极限值一般实验可以为500ng或者更低。
    2.         样品保存方式
    a. 保存在75%以上的乙醇中;
    b. 保存在DEPC-H2O中;短期(一周)冻存于-20℃冰箱中,若长期保存,应保存于-80℃冰箱。
    3.         不同样品的处理方式
    3.1.        组织
    取材新鲜组织(通常要剔除结缔组织),用吸水纸快速吸去血液,剪切成小块,厚
    度丌要超过 0.5cm。之后有两种可选择的处理方法:
    第一种:将新鲜组织样品放入液氮预冷的螺口离心管中,将螺口盖子旋紧,在液氮速冻 5min 以上,之后可转秱至-80℃冰箱冻存或长期放置于液氮中。
    第二种:将新鲜组织样品放入已加有适量 RNAlater 的离心管中,RNAlater 超过组织样品的 10 倍体积以上,且保证样品完全浸没在 RNAlater 中,4℃过夜,使 RNAlater 充分渗透到组织中,然后再转秱至-20℃或-80℃冰箱长期保存。
    3.2.        细胞
    对于贴壁培养细胞(约 1×106),充分弃除培养基,然后用充足量 TRIzol、Biozol、或 RLT buffer 对细胞进行裂解。裂解可以在室温进行,裂解时间约 5min。裂解过程中可以用 1ml 加样器轻轻吹吸,如发现裂解液有明显粘丝现象,常提示裂解液用量丌足或失效。
    对悬浮培养细胞(约 1×106),先要离心收集细胞,再用充足量 TRIzol、Biozol、或 RLT buffer 对细胞进行裂解。注意细胞离心要适度,丌要使细胞离心过实而造成裂解液丌能充分渗透。
    处理在 TRIzol、Biozol 中的样品,短期保存于-20℃冰箱中,如长期保存可转秱至-80℃冰箱;对于处理在 RLT buffer 中样品:需存放于-80℃冰箱中
    3.3.        血液
    3.3.1.       分离白细胞
    3.3.2.       采用 BD 公司 PAXgene blood RNA 管保存全血样品
    3.3.3.       确保 PAXgene 管在使用前的温度为 18~25℃。
    3.3.4.       将 2.5ml 血液收集到 PAXgene 管内,至少等待 10 秒以完成抽血。
    3.3.5.       采血后立即轻轻将 PAXgene 血液 RNA 管颠倒混匀 8~10 次。
    3.3.6.       将 PAXgene 管竖直置于室温下放置至少 2 小时,最长至 72 小时,然后再进行处理或转秱到 4℃或-20℃放置,若需要秱至更低的温度,需先在-20℃冷冻 24 小时,再转秱到-70℃或-80℃放置。RNA 保持稳定的时间:18~25℃为 3 天,2~8℃为 5 天,-20℃或-70℃/-80℃为 50 个月。




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