高分辨率熔解曲线PCR（HRM-PCR）
高分辨率熔解曲线PCR (HRM-PCR) 服务
高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）是一种基于核酸物理性质的新型突变扫描及基因分型技术。通过实时监测双链DNA在升温过程中的荧光变化，捕捉单个碱基差异导致的熔解温度（Tm）微小偏移。无需探针、闭管操作、低成本、高通量，适用于SNP筛查、突变检测、甲基化分析及物种鉴定。
超高分辨率
可检测单碱基差异（SNP、点突变），分辨率达0.01~0.1℃温度差异，灵敏度远高于传统熔解曲线。
闭管操作，避免污染
PCR扩增后直接进行熔解分析，无需开管或电泳，极大降低交叉污染风险，适合临床及筛查场景。
低成本、高通量
无需荧光探针，仅需饱和染料（如EvaGreen、LC Green），兼容96/384孔板，单次可检测数百样本。
广泛应用场景
未知突变扫描、已知SNP分型、甲基化差异检测、物种鉴定及等位基因频率估算。
样本/引物确认
靶标区域分析
PCR扩增
饱和荧光染料+优化体系
高分辨率熔解
0.01℃/步升温采集
数据分析
归一化处理/聚类分析
结果交付
熔解曲线+差异图谱
| 检测平台 | ABI QuantStudio 系列 / Roche LightCycler 480 / Bio-Rad CFX 等 （HRM专用模块） |
|---|---|
| 检测试剂 | 饱和荧光染料（EvaGreen / LC Green Plus / SYTO 9），无探针设计 |
| 样本类型 | gDNA、cDNA、PCR产物（纯化或未纯化） |
| DNA起始量 | 推荐 5-20 ng基因组DNA |
| 扩增子长度 | ** 60-150 bp（一般不超过400 bp） |
| 分辨率 | 单碱基差异清晰区分，熔解曲线差异≥0.1℃可分辨 |
| 检测变异类型 | SNP、小片段插入缺失（Indel）、甲基化差异（需重亚硫酸盐处理）、等位基因频率估算 |
| 通量 | 96孔/384孔板，每样本≤4小时（含PCR+熔解） |
| 交付内容 | 原始熔解曲线图、归一化差异图、温度偏移矩阵、基因分型结果（聚类图）、实验报告 |
| 周期 | 样本接收后5-7个工作日（常规项目） |
原始熔解曲线
荧光强度 vs 温度，观察不同基因型/突变型熔解曲线形状差异。
归一化差异图
将原始曲线归一化至特定温度范围，差异图更直观区分不同基因型簇。
主成分分析/聚类
采用PCA或自动聚类算法，根据熔解曲线特征将样本分型，区分纯合/杂合/野生型。
阳性质控验证
每批次包括已知基因型对照（野生型/杂合/纯合突变），确保分型准确性。
未知突变扫描
疾病相关基因（如BRCA1/2、EGFR、KRAS）未知突变筛査。
SNP基因分型
药物代谢酶SNP、性状关联位点批量分型（如CYP2C19、MTHFR）。
甲基化检测（Methy-HRM）
重亚硫酸盐处理后，根据甲基化差异导致的熔解曲线偏移定量甲基化比例。
种质资源/物种鉴定
基于DNA条形码区域的HRM区分不同品种或近缘物种。
肿瘤体细胞突变检测
低丰度突变（5%~10%）灵敏度检测，与qPCR互补。
等位基因频率估算
混池DNA中特定等位基因丰度快速估计。
一、样本类型
• 组织样本：新鲜/冻存组织 ≥ 50mg，避免降解
• 细胞样本：贴壁/悬浮细胞 ≥ 1×10⁶个
• 全血/唾液：≥ 500μL，EDTA抗凝，禁用肝素
• DNA样本：体积 ≥ 20μL，浓度 ≥ 30ng/μL，无蛋白/RNA污染
• 甲基化样本：需提供重亚硫酸盐转化后DNA
二、样本保存运输
• 组织/细胞：-80℃保存，干冰运输
• 全血样本：4℃短期保存，72小时内送达
• DNA样本：-20℃保存，冰袋运输，避免反复冻融
三、信息提供
• 样本名称、分组、检测位点、物种信息
• 目标SNP/突变位点ID或序列信息
• 分型需求、内参基因、实验重复次数