Full Moon BioSystems抗体芯片常见问题解答-实验步骤相关问题

问：需要多少细胞才能获得100微克的蛋白质？
答：细胞中蛋白质的含量因细胞类型而异。我们通常使用100万至500万个细胞来获得200-400微克的蛋白质。

问：我可以使用其他类型的裂解和/或提取缓冲液，而不是芯片实验套装中提供的提取缓冲液吗？
答：可以，您可以使用其他裂解缓冲液来裂解细胞和组织；但是，缓冲液中不得含有Tris。细胞裂解液或提取的蛋白质样本中存在Tris会对接蛋白质样本的生物素标记产生不利影响。例如，Pierce Biotechnology的RIPA裂解和提取缓冲液中含有Tris。如果使用了这种缓冲液提取蛋白质，请务必在下一步之前将缓冲液从蛋白质提取物中移除，并替换为抗体芯片实验套装中提供的标记缓冲液。我们推荐以下用于缓冲液交换（去除Tris）的柱子：抗体芯片实验套装中包含的旋转柱；Millipore的Microcon YM-10滤器（目录号：42406）；Sephadex G-25柱。

问：我需要使用微珠进行细胞分离和纯化。微珠会干扰抗体芯片吗？
答：一般来说，用于分离和纯化的微珠不会影响抗体芯片实验。

问：我可以在裂解液中添加蛋白酶抑制剂吗？
答：抗体芯片实验套装中提供的试剂不含蛋白酶或磷酸酶抑制剂。为了防止蛋白质降解，一旦开始提取，您应快速操作并认真进行芯片分析步骤。或者，如果您愿意或计划将蛋白质储存一周以上，可以使用抑制剂。

问：偶联需要多少蛋白质？
答：通常使用60-100微克的总蛋白质进行生物素标记和偶联。

问：封闭和偶联后用去离子水（DI水）充分冲洗玻片有多重要？
答：用去离子水充分冲洗玻片极其重要。玻片表面残留的任何试剂可能会导致背景不均匀。用去离子水充分冲洗玻片有助于获得更好的背景均匀性。

问：我可以使用其他染料-链霉亲和素代替Cy3-链霉亲和素进行检测吗？
答：可以。Cy3-链霉亲和素并不是**的选择。染料的选择取决于您扫描仪的规格。对于常用的532纳米和635纳米激光器，检测试剂包括Cy3或Cy5-链霉亲和素，或Alexa Fluor 555或647标记的链霉亲和素。

问：获得良好结果的关键步骤是什么？
答：获得良好结果的**个关键步骤是蛋白质提取。确保每10分钟用涡旋器将微珠与细胞/组织混合30秒，持续1小时。这个过程将完全破坏细胞/组织并释放蛋白质。如果您处理的是组织，请务必尽可能去除血液。样本中残留的血液可能会导致高背景和非特异性结合。其次，细胞裂解液上清液必须非常澄清。上清液中的杂质（脏裂解液）可能会导致标记效率低和非特异性结合。确保仅使用上层澄清的裂解液上清液进行标记。上清液应像水一样清澈透明。如果提取协议结束时上清液仍然浑浊（不透明），将其在-70℃冷冻10分钟，然后以10000xg离心，保留澄清的上清液层。

另一个重要步骤是用去离子水冲洗。封闭、偶联和检测后，用去离子水彻底清洗玻片至关重要。如有需要，可增加清洗次数。清洗时摇动水面，这有助于去除玻片表面的残留试剂。